細(xì)胞色素P450酶系體外藥物代謝研究方法進(jìn)展

來(lái)源：中國(guó)藥事2013年第27卷第1期

作者：于敏，張雙慶，聞鎳，李佐剛

中國(guó)食品藥品檢定研究院食品藥品安全評(píng)價(jià)研究所

摘要

目的：綜述細(xì)胞色素P450（CYP450）酶影響藥物代謝的體外研究方法。

方法：參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)與藥物代謝相關(guān)的CYP酶亞型、CYP酶種屬差異、CYP酶體外反應(yīng)體系、藥物主要代謝酶的確認(rèn)方法及體外CYP酶的抑制和誘導(dǎo)，進(jìn)行分類(lèi)、歸納和整理。

結(jié)果與結(jié)論：CYP450在藥物代謝中具有重要作用，藥物代謝研究是新藥評(píng)價(jià)體系中重要的一部分。

關(guān)鍵詞

細(xì)胞色素P450酶；藥物代謝；藥物相互作用；體外研究

藥物進(jìn)入機(jī)體后主要以?xún)煞N方式被清除：一種是藥物不經(jīng)任何代謝而直接以原型形式排出體外；另一種是部分藥物在體內(nèi)經(jīng)代謝后，再以原型和代謝物的形式排出體外。當(dāng)藥物主要通過(guò)代謝被清除時(shí)，代謝途徑可顯著影響藥物的安全性、療效及用法。

藥物的代謝，也稱(chēng)為生物轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)主要有兩個(gè)步驟：第1步稱(chēng)為Ⅰ相代謝反應(yīng)，藥物在這相反應(yīng)中被氧化、還原或水解；催化Ⅰ相反應(yīng)的酶主要為肝微粒體中的細(xì)胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450）。

第二步稱(chēng)為Ⅱ相代謝反應(yīng)，藥物在這一相反應(yīng)中與一些內(nèi)源性的物質(zhì)（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）結(jié)合或經(jīng)甲基化、乙酰化后排出體外；催化Ⅱ相反應(yīng)的酶有許多，其中主要的有葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶等。

在上述的代謝反應(yīng)中，由P450酶所催化的Ⅰ相反應(yīng)是藥物在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性步驟，因?yàn)檫@一步反應(yīng)常常是藥物從體內(nèi)被清除的限速步驟，它可以影響到藥物許多重要的藥動(dòng)學(xué)特性，如藥物的半衰期、清除率和生物利用度等［１］；此外，若藥物通過(guò)單個(gè)代謝途徑被清除，則代謝速率的個(gè)體差異可導(dǎo)致血液和組織中的藥物和代謝產(chǎn)物濃度出現(xiàn)巨大差異。

1細(xì)胞色素P450酶

細(xì)胞色素P450酶，是一種以鐵卟啉為輔基的蛋白質(zhì)，不僅分布于肝臟，小腸和腎臟也有表達(dá)，由血紅素蛋白（P450）、黃素蛋白（NADPH－細(xì)胞色素Ｃ還原酶）及磷脂三部分組成，相對(duì)分子質(zhì)量為45000～55000Da。P450酶系由Ｋｌｉｎｇｂｅｒｇ和Ｇｏｒｆｉｎｋｌｅ在1958年發(fā)現(xiàn)的，由于它在還原狀態(tài)下可以與CO結(jié)合，并在波長(zhǎng)為450ｎｍ 時(shí)有大吸收峰，因此而得名［２］。該酶有許多同工酶，故稱(chēng)細(xì)胞色素P450酶系，簡(jiǎn)稱(chēng)為CYP450S。CYP450S的命名方法：第1個(gè)數(shù)字表示族，第二個(gè)英文字母表示亞族，第三個(gè)數(shù)字表示某種特定的酶， 如CYP2D6［３］。

CYP450S的分類(lèi)：CYP450S是一組由許多同工酶組成的超基因大家庭，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，人類(lèi)編碼CYP450S的基因已基本明確，由18個(gè)基因家族，43個(gè)亞家族，57個(gè)基因，59個(gè)假基因組成。

在人類(lèi)肝臟各種代謝酶中，CYP3A4、CYP2C、CYP1A2和CYP2E1分別占29%，17%，１2% 和6%，CYP2A6 占4%，CYP2D6占1%［４］。雖然有18個(gè)基因家族，但是大約95%的藥物氧化作用由６種CYP酶催化執(zhí)行，其中CYP3A4占３５％，CYP2D6占１５％，CYP1A2占１２％，CYP2C9占９％，CYP2C19占８％，CYP2B6和CYP2E1均占６％，CYP2A6占３％［５］。

該酶系具有以下幾方面的生物學(xué)特性：

（１）P450酶是一個(gè)多功能的酶系，可以催化60種以上的代謝反應(yīng)，它可作為單加氧酶、脫氫酶、還原酶、過(guò)氧化酶、酯酶等而催化代謝反應(yīng)，因此P450酶可以催化一種底物同時(shí)產(chǎn)生幾種不同的代謝物；

（２）P450酶對(duì)底物結(jié)構(gòu)的特異性不強(qiáng)，可代謝各種類(lèi)型化學(xué)結(jié)構(gòu)的底物，每一種P450酶都有廣泛的底物，既能代謝大分子底物，也能代謝小分子的底物；

（３）P450酶存在有明顯的種屬、性別和年齡差異。

其中以種屬差異表現(xiàn)-為明顯，不同種屬的P450同工酶組成不同，因此藥物在不同種屬動(dòng)物和人體內(nèi)的代謝途徑及代謝產(chǎn)物可能不同。這是由于P450在不同種屬中基因表達(dá)上的差異所造成的，P450酶在不同種屬的動(dòng)物和人體內(nèi)的表達(dá)有質(zhì)和量的差異，因此不同種屬動(dòng)物和人體內(nèi)的P450酶底物和產(chǎn)物特異性及P450酶活性可以不同。這是造成代謝種屬差異的主要原因，因此我們不能*用動(dòng)物P450酶來(lái)代替人的P450酶進(jìn)行研究，具體的CYP酶亞型見(jiàn)表１。

P450酶的性別差異在大鼠體內(nèi)表現(xiàn)-為明顯，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)雌雄大鼠體內(nèi)P450同工酶的組成有明顯的質(zhì)和量的差異，某些藥物在雌、雄大鼠體內(nèi)的主要代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能是不同的，因而造成其在雌雄大鼠體內(nèi)的毒性也存在明顯的差異，這值得引起臨床前藥動(dòng)學(xué)和毒理學(xué)研究的重視。

P450酶在年齡上的差異主要表現(xiàn)在酶量和活性方面［６］；

（４）P450酶具有多型性，它是一個(gè)*家族，每種哺乳動(dòng)物至少有３０種以上的P450酶，由此可見(jiàn)P450酶系是由多種類(lèi)型的P450酶所組成的一個(gè)龐大家族；

（５）P450 酶具有多態(tài)性（PｏｌｙｍｏｒPｈｉｓｍ），即同一種屬的不同個(gè)體間某些P450酶的活性存在較大差異，可將個(gè)體按代謝速度的快慢分為四種表型：弱代謝型（PＭｓ）是缺乏功能酶，中等代謝型（ＩＭｓ）是等位基因缺失雜合子，強(qiáng)代謝型（ＥＭｓ）是攜帶兩個(gè)功能基因拷貝，和*代謝型（ＵＭｓ）是攜帶兩個(gè)以上功能基因拷貝。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人肝P450 酶中，CYP1A1-3、CYP2C8-9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A3-4均表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，其中以CYP2D6和CYP2C19的多態(tài)性-為典型，如由CYP2C19參與的S-美芬妥因的羥化代謝就表現(xiàn)出典型的多態(tài)性，即不同個(gè)體對(duì)S-美芬妥因的羥化代謝速度存在非常顯著的差異，按代謝速度可以將人群分為兩種類(lèi)型，即PＭｓ 和ＥＭｓ，前者的血藥濃度明顯高于后者，PＭｓ的ＡＵＣ值（藥－時(shí)曲線(xiàn)下面積）顯著升高，消除半衰期明顯延長(zhǎng)。

P450酶的多態(tài)性主要是由于其基因缺陷所致，這種基因缺陷可能是由于遺傳變異所造成的。

P450酶的多態(tài)性不僅表現(xiàn)在同一種屬的不同個(gè)體間，同時(shí)不同種族間的代謝缺陷發(fā)生率也存在顯著差異，如CYP2D6在不同種族中的PＭｓ的發(fā)生率就存在明顯的種族差異，黃種人對(duì)異喹胍的代謝缺陷（即PＭｓ）發(fā)生率為１％左右，黑人的代謝缺陷發(fā)生率為０％～２％，而白種人的代謝缺陷發(fā)生率高達(dá)５％～１０％［７］。

（６）P450酶具有可誘導(dǎo)性和可抑制性。

一方面包括藥物在內(nèi)的很多化學(xué)異物可對(duì)P450酶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使某些P450酶的量和活性明顯增加。

人們較早發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，其中典型的例子就是苯-巴比妥可以誘導(dǎo)肝P450酶，從而加速其自身的代謝，使其鎮(zhèn)靜、催眠作用減弱。

另一方面，許多外源性的化學(xué)異物包括許多藥物可以選擇性地抑制某些P450酶，使其活性明顯降低，因而可以抑制其對(duì)其他化學(xué)異物的代謝［８］。

2細(xì)胞色素P450酶系藥物代謝研究方法

2.1 所需材料和儀器

受試藥物，混合肝微粒體，磷酸鉀緩沖液（PＨ７．４，５０～１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１），NADPH再生系統(tǒng)（匯智泰康NADPH再生系統(tǒng)，包括Solution A和SolutionB兩種試劑，臨用混合，Ａ試劑含有３１ｍＭＮＡＤP＋、６６ｍＭＧ－６－P和６６ｍＭＭｇＣｌ２，Ｂ試劑含有４０Ｕ·ｍＬ－１Ｇ－６－PＤＨ，其再生原理為Ｇ－６－PＤＨ 催化Ｇ－６－P脫氫，并將ＮＡＤP＋轉(zhuǎn)化為ＮＡＤPＨ，其中Ｍｇ２＋ 是Ｇ－６－PＤＨ 催化反應(yīng)所必需的輔助因子）或者市售的NADPH 和ＭｇＣｌ２，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，離心機(jī)，３７°Ｃ水浴搖床，超低溫冰箱。

2.2 所需溶液的配制

反應(yīng)緩沖液（50mmol· L-1PH7.4匯智泰-康磷酸鹽緩沖液），反應(yīng)啟動(dòng)液（Solution A和SolutionB臨用前４°Ｃ過(guò)夜解凍，置冰浴中，按５∶１ （ｖ／ｖ）混合，再加入反應(yīng)緩沖液稀釋至ＮＡＤP＋含量約為１ｍｍｏｌ·Ｌ－１后使用）／ （１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＮＡＤPＨ 溶液和５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２），反應(yīng)終止液（冰冷的內(nèi)標(biāo)甲醇溶液，－２０°Ｃ儲(chǔ)存，加入３倍體積終止反應(yīng)），肝微粒體（匯-智泰康可提供猴肝微粒體，大鼠肝微粒體，小鼠肝微粒體等）溶液（－７０°Ｃ取出后３７°Ｃ水浴１ｍｉｎ快速解凍，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中用反應(yīng)緩沖液稀釋至０．２ｍｇ·ｍＬ－１，不可反復(fù)凍融），受試藥物儲(chǔ)備液及工作液，內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 建立反應(yīng)體系

（１）NADPH溶液、微粒體溶液、受試藥物工作液和反應(yīng)緩沖液放入３７°Ｃ水浴中，５０ｒPｍ下恒溫５ｍｉｎ；（２）取不同摩爾濃度的受試藥物工作液１５０μＬ，加入０．２ｍｇ·ｍＬ－１的微粒體溶液６０μＬ，不建議渦旋混勻，加入反應(yīng)啟動(dòng)液ＮＡＤPＨ 再生系統(tǒng)９０μＬ混勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)；（３）分別于孵育不同時(shí)間取出２０μＬ孵育液，轉(zhuǎn)移到冰浴上，加入３倍體積反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，渦旋，離心，取上清液１０μＬＬＣ－ＭＳ／ＭＳ進(jìn)樣分析［９］；（４）根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化孵育時(shí)間、底物濃度、微粒體蛋白濃度。

2.4 反應(yīng)體系注意事項(xiàng)

２．４反應(yīng)體系注意事項(xiàng)

（１）體外孵育條件：緩沖體系的選擇，緩沖體系的離子強(qiáng)度，孵育環(huán)境PＨ 值，孵育時(shí)間和微粒體蛋白濃度都會(huì)影響酶促反應(yīng)的代謝速度。

底物濃度應(yīng)當(dāng)過(guò)量，大于酶適底物濃度約１０倍，且反應(yīng)消耗量應(yīng)當(dāng)＜２０％。

（２）有機(jī)溶劑的影響：由于許多P450酶底物和抑制劑都是強(qiáng)疏水性化合物，建立水性反應(yīng)體系時(shí)，不可避免會(huì)用到甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亞砜（DMSO）等有機(jī)溶劑。

但是，有機(jī)溶劑會(huì)影響天然酶反應(yīng)環(huán)境和酶活性，從而改變酶－底物相互作用，因此，有機(jī)溶劑的濃度要求＜１％ （ｖ／ｖ），-好＜０．１％。

（３）非特異性微粒體結(jié)合：因?yàn)榇蟛糠炙幬锒际侵苄杂袡C(jī)化合物，會(huì)與微粒體膜上的脂質(zhì)蛋白產(chǎn)生非特異性結(jié)合，使得游離的底物濃度小于添加濃度。

會(huì)出現(xiàn)基于添加濃度的表觀(guān)Ｋｍ值（米氏常數(shù)，即藥物在體內(nèi)的消除速度為Ｖｍ的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的血藥濃度）高于真實(shí)Ｋｍ，但其不影響Ｖｍａｘ值，導(dǎo)致高估了Ｋｍ值而低估了體內(nèi)藥物清除率（ＣＬ）。

因此，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化微粒體蛋白濃度，選用可定量代謝物的低蛋白濃度，使非特異性蛋白結(jié)合小化。

2.5 數(shù)據(jù)分析

2.5.1 典型酶促動(dòng)力學(xué)

典型的CYP介導(dǎo)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)符合米氏方程（公式１）特征，擬合動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，計(jì)算酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ｖｍａｘ和Ｋｍ，其中ｖ 是反應(yīng)速度， ［Ｓ］是底物濃度，Ｖｍａｘ是大反應(yīng)速度，Ｋｍ是米氏常數(shù)———表示達(dá)到大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。

從反應(yīng)式１得出Ｋｍ是反映速度的常數(shù)，Ｋｍ＝ ｋ－１＋ｋ２／ｋ１。

有報(bào)道稱(chēng)Ｋｍ是反映底物對(duì)酶的親和性，此說(shuō)法是不正確的［１０］。

因ｖ＝ＣＬｉｎｔ· ［Ｓ］，將米氏方程轉(zhuǎn)換得到公式２，通過(guò)Ｖｍａｘ和Ｋｍ值可以計(jì)算得到藥物的體外固有清除率，將體外清除率（ＣＬｉｎｔ）外推得到該藥物的體內(nèi)ＣＬｉｎｔ。

2.5.2 動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

通過(guò)擬合動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，可以快速求出參數(shù)值，而且可以初步判斷有無(wú)酶抑制現(xiàn)象或者是否是非典型酶促動(dòng)力學(xué)。

2.5.2.1 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ 作圖

以１／ｖ為ｙ軸，１／ ［Ｓ］為ｘ軸作圖，得到一條直線(xiàn)，直線(xiàn)的斜率即Ｋｍ／ｖ，ｙ軸截距是１／Ｖｍａｘ，ｘ軸截距是－１／Ｋｍ。

此作圖方法是常用的計(jì)算酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，但其會(huì)夸大底物濃度低時(shí)的錯(cuò)誤，故常用于初期參數(shù)評(píng)價(jià)，而不常用于終參數(shù)確定。

2.5.2.2 Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆ 作圖

以［Ｓ］／ｖ為ｙ軸，［Ｓ］為ｘ軸作圖，得到一條直線(xiàn)，直線(xiàn)的斜率即１／Ｖｍａｘ，ｙ軸截距是Ｋｍ／Ｖｍａｘ，ｘ軸截距是－Ｋｍ。

與前種方法比較，此作圖方法錯(cuò)誤概率小且恒定，是確定酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)更好的選擇。

2.5.2.3 Ｅａｄｉｅ－Ｈｏｆｓｔｅｅ 作圖

以ｖ為ｙ軸，ｖ／ ［Ｓ］為ｘ軸作圖，得到一條直線(xiàn)，直線(xiàn)的斜率即－Ｋｍ，ｙ軸截距是Ｖｍａｘ，ｘ軸截距是Ｖｍａｘ／Ｋｍ。

此作圖方法因ｘ軸是速度，是一個(gè)變量，會(huì)引入更多的實(shí)驗(yàn)誤差。值得關(guān)注的是，根據(jù)此作圖方法擬合曲線(xiàn)的形狀可以判斷非典型酶促動(dòng)力學(xué)的類(lèi)型。

2.5.3 非典型酶促動(dòng)力學(xué)

大部分CYP酶介導(dǎo)的藥物代謝反應(yīng)符合典型酶促動(dòng)力學(xué)的雙曲線(xiàn)模型，但是一些P450酶會(huì)呈非典型酶促動(dòng)力學(xué)，是由于酶和底物分子具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)造成動(dòng)力學(xué)行為的改變。

非典型酶促動(dòng)力學(xué)有四種模型：反曲線(xiàn)同向協(xié)同（ＨｏｍｏｔｒｏPｉｃＣｏｏPｅｒａｔｉｖｉｔｙ：ＳｉｇｍｏｉｄａｌＫｉｎｅｔｉｃｓ），二段式同向協(xié)同（ＨｏｍｏｔｒｏPｉｃＣｏｏPｅｒａｔｉｖｉｔｙ：ＢｉPｈａｓｉｃＫｉｎｅｔｉｃｓ），底物抑制動(dòng)力學(xué)和異向協(xié)同（ＨｅｔｅｒｏｔｒｏPｉｃＣｏｏPｅｒａｔｉｖｉｔｙ）。

同向協(xié)同是兩個(gè)相同的底物分子協(xié)同作用的結(jié)果，異向協(xié)同是兩個(gè)結(jié)構(gòu)上*不同的底物分子協(xié)同作用的結(jié)果。

2.5.4 酶抑制動(dòng)力學(xué)

此效應(yīng)是緣于抑制劑效應(yīng)分子的存在，使得酶被抑制，底物反應(yīng)速度下降。

通過(guò)體外酶抑制動(dòng)力學(xué)可以預(yù)測(cè)可能存在的藥物－藥物相互作用。

其中對(duì)酶的抑制作用按機(jī)理分為可逆性，半可逆性和不可逆性三類(lèi)。

不可逆性抑制是抑制劑（也可稱(chēng)滅活劑Ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ）和酶形成的結(jié)合物被酶激活后不可逆地使酶失去活性，其呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，往往抑制劑從體內(nèi)清除后其抑制作用還會(huì)存在一段時(shí)間。

可逆性抑制（ＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）包括三種：競(jìng)爭(zhēng)性抑制（ＣｏｍPｅｔｉｔｉｖｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ），非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（ＮｏｎｃｏｍPｅｔｉｔｉｖｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ） 和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（ＵｎｃｏｍPｅｔｉｔｉｖｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）。

競(jìng)爭(zhēng)性抑制是簡(jiǎn)單常見(jiàn)的類(lèi)型，是抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)游離酶的結(jié)合部位，對(duì)反應(yīng)的Ｖｍａｘ不產(chǎn)生影響，會(huì)增加Ｋｍ值，可以用公式３來(lái)表示。

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制比較少見(jiàn)，是抑制劑與底物可逆性地結(jié)合，對(duì)Ｋｍ不產(chǎn)生影響，會(huì)降低Ｖｍａｘ，通常認(rèn)為混合抑制的初期表現(xiàn)為此抑制現(xiàn)象。

反競(jìng)爭(zhēng)性抑制是抑制劑只與酶－底物復(fù)合物結(jié)合，而不與游離酶結(jié)合，使得Ｋｍ和Ｖｍａｘ都變小，但Ｖｍａｘ／Ｋｍ比值不變，可以用公式４來(lái)表示。

此外，還有混合抑制（ＭｉｘｅｄＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ），表現(xiàn)為Ｖｍａｘ降低，Ｋｍ增高，由于多種結(jié)合機(jī)制造成，抑制劑可與底物競(jìng)爭(zhēng)游離酶的結(jié)合部位，抑制劑先結(jié)合酶分子再與底物結(jié)合，抑制劑還可結(jié)合酶－底物復(fù)合物。

ＩＣ５０和Ｋｉ通常用來(lái)表示一個(gè)化合物的抑制能力，但兩者不等同。

Ｋｉ＝ ［Ｅ］［Ｉ］／ ［ＥＩ］，由多個(gè)底物濃度（通常３～４種）和多個(gè)抑制劑濃度（通常４～５種）確定；ＩＣ５０是由一個(gè)底物濃度和多個(gè)抑制劑濃度確定。

ＩＣ５０表示底物代謝被抑制５０％時(shí)的抑制劑濃度，Ｋｉ是酶－抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù)。

ＩＣ５０與底物濃度以及酶濃度相關(guān)，Ｋｉ值與此類(lèi)因素?zé)o關(guān)，故只有在相同底物濃度和相同酶濃度時(shí)ＩＣ５０值才可以相互比較，而不同底物的Ｋｉ值可以相互比較。

此外，當(dāng)?shù)孜餄舛确浅＝咏耍碇禃r(shí)，ＩＣ５０／２等于Ｋｉ。

3確定受試藥物的代謝途徑和主要代謝產(chǎn)物

代謝途徑鑒定實(shí)驗(yàn)，是將藥物和不同種系（匯智泰康不同種系肝微粒體，大鼠肝微粒體，比格犬肝微粒體，小鼠人肝微粒體，人肝微粒體等）的混合肝微粒體一起孵育，或用肝細(xì)胞或者肝臟部分組織培養(yǎng)藥物，然后通過(guò)HPLC-MS/MS分析孵育介質(zhì)或培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)容物，可以大致確定該藥物是否是肝微粒體P450酶的底物，可以直接獲得氧化、水解或基團(tuán)轉(zhuǎn)移形成的代謝物，提供平行代謝還是先后代謝的信息，以及主要代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能存在的種屬差異。

此項(xiàng)分析需要借助代謝物譜預(yù)測(cè)篩查軟件進(jìn)行。

4藥物代謝酶的確認(rèn)并注意CYP酶的種屬差異

如果CYP酶對(duì)藥物的代謝量大于藥物總清除率的２５％，則應(yīng)當(dāng)進(jìn)行CYP酶鑒定研究，也稱(chēng)為反應(yīng)表型研究［１１］。

利用下述３種方法確認(rèn)不同的CYP酶對(duì)藥物代謝的貢獻(xiàn)。

4.1 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)對(duì)接預(yù)測(cè)

根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）提供的信息得到CYP450酶亞型的晶體結(jié)構(gòu)。

藥物－CYP450蛋白空間模擬對(duì)接時(shí)，主要基于空間位置上鄰近CYP450蛋白中血紅素和鐵氧離子的底物識(shí)別位點(diǎn)而進(jìn)行。

運(yùn)用軟件的對(duì)接程序，通過(guò)漸進(jìn)式構(gòu)造算法來(lái)計(jì)算優(yōu)化配基與底物識(shí)別位點(diǎn)間的相互作用，通過(guò)氫鍵和疏水作用的加合來(lái)計(jì)算自由能，進(jìn)而利用軟件的評(píng)分功能將計(jì)算所得的自由能數(shù)值求和后按照從小到大的順序排序。

4.2 特定的化學(xué)物質(zhì)或抗體作為特異性酶抑制劑

大部分化學(xué)抑制劑對(duì)各個(gè)CYP酶均無(wú)特異性，表２列出了實(shí)驗(yàn)可選用的特異性化學(xué)抑制劑［１２］。

藥物的濃度要≤ Ｋｍ值，盡可能在初始比率條件下（代謝產(chǎn)物產(chǎn)生速率與時(shí)間和酶濃度呈線(xiàn)性）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

抑制劑均用甲醇溶解，采用一系列濃度。

當(dāng)使用基于作用機(jī)制的抑制劑（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ－ＢａｓｅｄＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）時(shí)，將抑制劑與酶預(yù)先孵育１５～３０ｍｉｎ。同時(shí)，還應(yīng)注意同一抑制劑對(duì)不同種屬同一CYP酶的靈敏度不同。

選擇足夠低和足夠高的抗體濃度來(lái)對(duì)抑制抗體的抑制作用進(jìn)行試驗(yàn)，以確定滴度曲線(xiàn)。

4.3 應(yīng)用不同的重組CYP酶

這種技術(shù)對(duì)研究單個(gè)CYP酶在整個(gè)藥物代謝中的相對(duì)貢獻(xiàn)的大小具有很高的價(jià)值，但不能代表人肝微粒體在體外的代謝比率。

重組酶孵育體系與肝微粒體相似，除CYP2A6和CYP2C9的反應(yīng)介質(zhì)為Ｔｒｉｓ緩沖液（PＨ７．５）外，其他酶的介質(zhì)均為磷酸鉀緩沖液（PＨ７．４）。

5確定受試藥物是否是肝微粒體P450酶的抑制劑

5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

（１）將藥物與合適的探針底物［１２］ （見(jiàn)表３）和相應(yīng)的CYP450酶共培養(yǎng)。

（２）測(cè)定ＩＣ５０時(shí)，在底物代謝率允許的情況下，盡量使底物濃度低于Ｋｍ值，使ＩＣ５０與Ｋｉ值更具相關(guān)性。

（３）肝微粒體蛋白濃度通常＜１ｍｇ·ｍＬ－１。

（４）緩沖液的性質(zhì)、PＨ 對(duì)Ｖｍａｘ和Ｋｍ會(huì)有影響，盡可能采用標(biāo)準(zhǔn)化分析條件。

（５）反應(yīng)系統(tǒng)中控制底物或抑制劑的消耗不超過(guò)１０％～３０％，但是對(duì)于Ｋｍ值很低的藥物來(lái)說(shuō)，控制反應(yīng)體系底物消耗＜１０％很困難。

（６）建議時(shí)間－產(chǎn)物形成量呈線(xiàn)性關(guān)系。

（７）建議酶量－產(chǎn)物形成量呈線(xiàn)性關(guān)系。

（８）所有溶劑的濃度都要＜１％ （ｖ／ｖ），-好＜０．１％，同時(shí)設(shè)立無(wú)溶劑對(duì)照。

（９）實(shí)驗(yàn)設(shè)立一個(gè)已知抑制劑的陽(yáng)性對(duì)照（見(jiàn)“４．２”項(xiàng)下）。

（１０）結(jié)果分析，確定受試藥物是否是可逆性抑制劑，是否是基于作用機(jī)制抑制劑［１１］。

5.2 確定受試藥物是否是可逆性抑制劑

理論上，抑制劑在作用部位的濃度與底物的Ｋｉ值相當(dāng)或超過(guò)Ｋｉ時(shí)會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。相互作用程度（以Ｒ表示，代表底物ＡＵＣ改變的倍數(shù)）可以通過(guò)Ｒ＝１＋ ［Ｉ］／Ｋｉ進(jìn)行評(píng)估，［Ｉ］是酶活性部位暴露的抑制劑濃度，代表了給予-高推薦臨床劑量后，所有藥物（結(jié)合和未結(jié)合）的平均穩(wěn)態(tài)Ｃｍａｘ值；Ｋｉ是抑制常數(shù)。

目前推薦根據(jù)［Ｉ］／Ｋｉ可以預(yù)測(cè)體內(nèi)相互作用的可能性，比值升高，產(chǎn)生相互作用的可能性增大［１３］，見(jiàn)表４。

盡管通過(guò)體外數(shù)據(jù)定量預(yù)測(cè)體內(nèi)相互作用發(fā)生的可能性存在困難，但可以通過(guò)同一個(gè)藥物對(duì)不同CYP 酶（CYP1A2， CYP2C8， CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A）的［Ｉ］／Ｋｉ值進(jìn)行篩選排序。

采用大［Ｉ］／Ｋｉ比值的CYP開(kāi)展體內(nèi)研究，如果該CYP顯示無(wú)體內(nèi)相互作用，則無(wú)需進(jìn)行其他CYP體內(nèi)評(píng)價(jià)研究。

對(duì)于CYP3A的抑制劑，建議評(píng)價(jià)２個(gè)結(jié)構(gòu)不相關(guān)的底物，如果其中一個(gè)顯示有潛在相互作用，則應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)。

5.3 確定受試藥物是否是基于作用機(jī)制抑制劑

體外實(shí)驗(yàn)還應(yīng)進(jìn)行時(shí)間依賴(lài)抑制篩查，建議加入底物前，對(duì)潛在抑制劑進(jìn)行３０ｍｉｎ預(yù)培養(yǎng)，起始產(chǎn)物形成率的所有時(shí)間依賴(lài)性及濃度依賴(lài)性損失均表明為作用機(jī)制性抑制［１４］。

6

確定受試藥物是否是肝微粒體P450酶的誘導(dǎo)劑

6.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)

（１）受試藥物的濃度應(yīng)該參考臨床治療劑量的血藥濃度，至少包括３個(gè)涵蓋治療窗的篩選濃度，其中至少１個(gè)濃度要超過(guò)平均預(yù)測(cè)血藥濃度１個(gè)數(shù)量級(jí)。

（２）與完整的單層肝細(xì)胞或分離的微粒體共孵育２～３ｄ后，通過(guò)CYP特異的探針底物（見(jiàn)表３），參照“５．１”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定酶活性。

（３）應(yīng)包括一個(gè)*的酶誘導(dǎo)劑［１２］ （見(jiàn)表５）作為陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)減小不同供體酶催化活性差異引起的誤差。

6.2 酶誘導(dǎo)終點(diǎn)預(yù)測(cè)

受試藥物體外實(shí)驗(yàn)引起的酶活性的改變≥４０％陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果時(shí)，可以認(rèn)為藥物具有酶誘導(dǎo)作用，需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究。

根據(jù)目前了解的CYP酶誘導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，如果一個(gè)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)顯示CYP3A4酶沒(méi)有誘導(dǎo)作用，可以推斷此藥物對(duì)CYP2C8，CYP2C9和CYP2C19也沒(méi)有誘導(dǎo)作用［１５］。

6.3 其他方法

除直接測(cè)定酶活性方法外，還有一些其他的方法確定誘導(dǎo)性。應(yīng)用特異性的多克隆抗體進(jìn)行ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ對(duì)酶進(jìn)行定量，該方法需要解決電泳技術(shù)對(duì)不同CYP酶的*分離問(wèn)題和抗體對(duì)CYP酶的特異性問(wèn)題。應(yīng)用ＲＴ－PＣＲ 技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)特定酶的ｍＲＮＡ表達(dá)水平，但有時(shí)ｍＲＮＡ的表達(dá)水平與酶活性的關(guān)系不能確定， 但是當(dāng)酶誘導(dǎo)作用（ｍＲＮＡ水平上調(diào)）和酶抑制作用（酶活性下調(diào)）同時(shí)存在時(shí)，ｍＲＮＡ的測(cè)定是有益的。對(duì)于受體介導(dǎo)的CYP酶誘導(dǎo)作用可以采用受體基因測(cè)定的方法，細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的CYP1A，CYP2B和CYP3A 酶誘導(dǎo)作用已經(jīng)被確認(rèn)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了高通量ＡｈＧ （芳烴受體）和PＸＲ （孕甾烷Ｘ受體）結(jié)合測(cè)定和細(xì)胞受體基因測(cè)定法，并用于篩選具有CYP1A和CYP3A誘導(dǎo)可能性的化合物。

參考文獻(xiàn)

文章來(lái)源：中國(guó)藥事２０１３年第２７卷第１期

北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司是一家位于中美兩地的生物醫(yī)藥合同研發(fā)機(jī)構(gòu)，整合中美兩地的藥物研發(fā)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，基于A(yíng)AALAC、GLP、ISO/IEC 17025實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證，面向企業(yè)及研發(fā)機(jī)構(gòu)提供分析化學(xué)、DMPK、藥理藥效、生物學(xué)、以及毒理安全性評(píng)價(jià)產(chǎn)品與服務(wù)。
主要產(chǎn)品：
體外藥物代謝產(chǎn)品
Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試劑盒
Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試劑盒
CYP450酶代謝表型研究試劑盒
不同種屬肝微粒體，肝S9
CYP450酶，標(biāo)準(zhǔn)品，孵育系統(tǒng)等

遺傳毒性產(chǎn)品
Ames試劑盒
體外染色體畸變?cè)囼?yàn)試劑盒
TK基因突變?cè)囼?yàn)試劑盒
HPGRT基因突變?cè)噭┖?/span>
彗星試驗(yàn)試劑盒
誘導(dǎo)大鼠肝S9等

空白生物基質(zhì)
空白血清：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠，豬，兔
空白血漿：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠，豬，兔
空白血：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠，豬，兔
空白尿液：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠